癌症中免疫激动剂抗体发展的前景和挑战（下篇）

前言

在上中篇中介绍了影响激动剂设计和功能的重要因素，这里介绍一下目前临床开发中的激动剂抗体以及与激动剂抗体相关的组合疗法，虽然激动剂抗体没有像PD1抑制剂那么瞩目，但也取得一系列重要进展，未来这些激动剂抗体将很有希望真正应用于肿瘤治疗中。

上篇：癌症中免疫激动剂抗体发展的前景和挑战（上篇）

中篇：癌症中免疫激动剂抗体发展的前景和挑战（中篇）

1目前的激动剂抗体

截至2018年4月，在临床开发中有25种不同的免疫激动剂抗体，针对七种不同的靶点（CD27、CD40、OX40、4-1BB、GITR、ICOS和CD28），正在48项组合试验中进行测试（表2）。另外六种抗CD30抗体也正在开发中，其具有针对表达CD30癌细胞的定向杀伤的主要机制。综述简要介绍了靶向相应共刺激受体的重组配体疗法。当然重组配体疗法仍然存在很多挑战，比如暴露的复杂性、免疫原性、稳定性和患者免疫谱等。重组配体疗法的临床研究很大程度上仍处于早期阶段，仍需要额外的数据来确定这些疗法的全部潜力。

表2：癌症中共刺激激动剂抗体的临床组合研究

2靶向CD27激动剂抗体

CDX-1127（Varlilumab）是目前临床开发用于治疗癌症中唯一靶向CD27的激动剂抗体。在2012年Varlilumab被描述为可以引发针对CD27⁺的白血病和T、B细胞淋巴瘤的直接抗肿瘤作用的抗体。由于Varlilumab是人IgG1，因此有人提出Varlilumab抗肿瘤活性是ADCC定向杀死T细胞和B细胞的结果。随后的研究表明，除了直接杀死CD27⁺的癌细胞外，Varlilumab还会因CD27⁺非致瘤性T细胞的激动剂激活而诱导抗肿瘤免疫。在晚期B细胞淋巴瘤患者中进行I期剂量递增研究观察到了一些临床活性，包括一个IV期霍奇金淋巴瘤患者获得了完全缓解（CR）¹⁰。然而，有人指出该患者的肿瘤细胞具有最高水平的CD27表达，难以确定临床活性是抗肿瘤免疫细胞的激动剂激活还是肿瘤细胞定向ADCC机制的结果。

另外也已在实体瘤中对Varlilumab进行研究并观察到临床和生物活性的证据，包括与CD27激活一致的免疫变化。Varlilumab已证明可以有效消耗T_reg细胞，并且是因为高水平的CD27表达使T_reg细胞成为了ADCC的靶标。Varlilumab正在针对选定的实体瘤以及血液系统恶性肿瘤进行持续的I/II期开发（表1）。此外，一些研究正在测试Varlilumab与免疫定向药物（抗PD1、抗PDL1和肿瘤疫苗）以及与针对肿瘤细胞和肿瘤微环境药物（抗VEGF和跨膜糖蛋白NMB抗体-药物偶联物）的组合。

3靶向CD40激动剂抗体

针对CD40的激动剂抗体是首批证明靶向癌症中免疫共刺激受体并且有治疗潜力的药物。近10年前开始在癌症患者中进行CD40激动剂抗体的临床试验，目前有六种抗CD40抗体正在进行临床试验。CD40抗体的发展路径和设计围绕CD40靶向的两种主要机制发生了分歧。一些抗体如selicrelumab（RO-7009789）已被设计为人IgG2同种型，可以强烈促进CD40激活，同时避免CD40⁺细胞通过ADCC和CDC机制耗竭。CD40在TNFR共刺激靶点中是独特的，其主要表达在APC中，诸如树突细胞、B细胞和巨噬细胞，而在T细胞中未明显发现CD40的表达。因此，CD40激动剂的主要机制是诱导抗原呈递以及APC增殖与功能。然而，CD40也在一些B细胞恶性肿瘤和实体瘤中表达，因此设计为人IgG1同种型的一些CD40抗体可通过CDC和ADCC的介导直接杀伤肿瘤细胞。有研究报导肿瘤细胞上CD40受体的激动剂激活可以独立于ADCC介导细胞凋亡，表明单独用CD40激动剂，如CP870883，也可以直接杀死肿瘤细胞。多项研究证实CD40激动剂抗体类药物在晚期癌症患者中存在临床活性信号，也观察到一些剂量限制性毒性作用和一些患者中度、瞬时细胞因子释放综合征（CRS）的情况¹¹。目前CD40激动剂抗体临床开发的重点在于其与其他免疫调节疗法联合使用，如抗CTLA4、抗PD1、抗PDL1和抗巨噬细胞集落刺激因子1受体（CSF1R）（表2）。虽然迄今为止报道的数据有限，但CD40激动剂的成功很可能是通过这些类型的免疫靶向组合。

4靶向OX40激动剂抗体

过去3年里有六种OX40激动剂抗体进入临床试验，很大程度归因于在小鼠肿瘤模型中用替代的OX40激动剂抗体观察到的抗肿瘤活性。从2000年的第一份报告开始，OX86大鼠IgG1克隆一直是主要的OX40激动剂抗体，用于小鼠肿瘤模型的大多数研究。在这些早期的研究中，OX86有希望的免疫刺激和抗肿瘤活性导致Providence Cancer Center和AgonOx开发了鼠单克隆抗人OX40激动剂抗体9B12（MEDI0562）。该鼠抗体于2006年进入人体临床试验。在试验治疗的30例患者中没有观察到肿瘤缓解，但是观察到明显的免疫调节活性，包括T细胞活化和增殖的增加。随后在小鼠模型中的许多研究证明了OX40激动剂与其他药物联合的抗肿瘤潜力，包括免疫检查点抗体、癌症疫苗、靶向抑制剂等。最近的研究表明小鼠中的抗肿瘤活性主要通过ADCC的FcγR依赖性T_reg细胞消耗来驱动的，指出该机制在用OX40激动剂抗体治疗的患者中潜在的重要性。临床开发的六种OX40激动剂抗体中有五种是人IgG1同种型，因此能通过ADCC耗尽OX40⁺细胞，包括T_reg细胞。与CD27激动剂抗体相比，临床数据显示OX40激动剂抗体对T_reg细胞的消耗相对较少。最近的非临床数据进一步混淆了OX40介导的细胞耗竭作用，显示当与疫苗抗原刺激联合使用时，抗PD1阻断抑制一些小鼠模型中OX40激动剂的抗肿瘤潜力。该研究中观察到的OX40和PD1组合的拮抗活性，一种可能的解释是PD1阻断可以增加CD4⁺效应子和CD8⁺细胞毒性T细胞群上的OX40表达，因此使得这些细胞也易受OX40耗竭的影响。在MMTV-PyMT乳腺癌模型中，并行的PD1阻断显著减弱了抗OX40激动剂抗体（OX86克隆）的治疗效果。与抗OX40单一疗法相比，用先抗OX40后阻断PD1的顺序疗法能显著增强肿瘤生长抑制和存活。这种现象也须在人体试验中仔细跟踪，因为目前正在进行至少8项将OX40激动剂与PD1或PDL1抗体相联合的试验。深入理解人类肿瘤中OX40激动剂抗体激活机制将有助于未来合理药物组合的研究，并且还可能指出药物顺序对于实现最佳治疗效果的重要性。目前正在进行的其他OX40激动剂组合包括PF-04518600与4-1BB激动剂utomilumab（PF-05082566）的组合以及MEDI0562（tavolimab）与CTLA4阻断剂tremelimumab的组合（表2）。此外临床前证据表明OX40激动剂与ICOS激动剂组合的可能性，然而尚未对此组合进行临床研究。

5抗GITR激动剂抗体

与OX40一样，激动剂激活GITR的许多治疗原理来自于21世纪初开发的单一抗小鼠激动剂抗体。DTA-1是大鼠IgG2b抗小鼠GITR激动剂抗体，小鼠模型研究表明其通过共刺激CD4⁺和CD8⁺ T细胞并抑制肿瘤内T_reg细胞的免疫抑制活性实现抗肿瘤活性。DTA-1还可以通过FcγR依赖性机制消耗肿瘤内的T_reg细胞，可能是由于GITR在肿瘤中T_reg细胞和其他T细胞中的高差异表达。小鼠中的GITR激动剂活性是否可以转化到人类中仍然是一个悬而未决的问题。但是，抗人GITR抗体（MK-4166）在人类T细胞中显示出免疫刺激和T_reg细胞抑制活性。有趣的是，来自该抗体的互补决定区也已被克隆为人源化IgG4（MK1248），其具有显著降低FcγR介导的效应子功能。MK-4166和MK-1248现在都处于癌症患者的I期临床研究中。经历人临床评估的其他四种GITR激动剂抗体是天然人IgG1，具有TRX518（非糖基化的人IgG1）缺乏的ADCC效应子功能。因此，确定FcγR介导的GITR⁺细胞消耗是否提供治疗优势或可靠性对于该领域是非常重要的。目前GITR激动剂抗体与PD1和CTLA4抗体的组合以及GITR激动剂抗体INCAGN01876和IDO拮抗剂epacadostat的组合正在研究测试中。对人类肿瘤微环境中GITR激动剂的免疫激活机制的理解对于正在进行的临床研究是相当关键的，将为未来合理的药物组合和药物顺序提供设计信息。

6抗4-1BB激动剂抗体

在免疫共刺激受体靶点中，激动剂激活4-1BB的支持数据是最引人注目的。小鼠肿瘤模型的数据、癌症患者的临床数据以及4-1BB胞内信号传导结构域在CAR自体T细胞疗法中的设计和成功临床应用都支持激动剂激活4-1BB的治疗原理。最近美国FDA批准了诺华公司的第一项CAR治疗（CTL019），其在CD19靶向CAR构造中包含4-1BB胞内信号传导结构域。在该CAR治疗中观察到显著的临床活性和持久反应，强调了4-1BB共刺激对于最佳T细胞活化和抗肿瘤反应的重要性。小鼠模型中的研究也显示了4-1BB激动剂抗体单独和与其他药物组合的潜在抗肿瘤活性。临床上，目前有两种4-1BB激动剂抗体用于癌症治疗，分别是urelumab和utomilumab。Urelumab在2005年首次进入人体临床试验，它是一种完全人IgG4，具有点突变（S228P）以稳定铰链区。与作为配体阻断剂的utomilumab不同的是urelumab不与4-1BB配体竞争结合。2008年，两项正在进行的评估urelumab作为单一治疗的临床研究由于肝毒性的发生而终止，后来认为是与urelumab给药剂量1mg/kg及以上的未知机制有关。随后，在2012年开始了一项新的单药治疗剂量递增研究，以评估剂量低于1mg/kg的单药治疗效果。小鼠中4-1BB激动剂的临床前研究也观察到一些肝毒性迹象，并且表明其与治疗后肝脏中CD8⁺ T细胞积累和活化的增加有关。Urelumab已经表明了一些疾病稳定和免疫激活的信号。一些正在进行的urelumab联合研究结合了ADCC抗体（包括靶向HER2、EGFR、SLAM家族成员7（SLAMF7）和CD20抗体）并利用抗体的NK细胞增强活性。另外，在多种癌症环境中urelumab也在与PD1阻断抗体nivolumab进行联合测试。第二临床阶段的4-1BB激动剂抗体utomilumab是由辉瑞公司开发的完全人IgG2，迄今为止在猴子和小鼠中显示出优异的非临床安全性，并且在剂量高达10mg/kg时对人类没有显示出剂量限制性毒性作用。在患有晚期实体瘤的患者中使用utomilumab单药治疗时观察到有希望的临床活性迹象和几种肿瘤缓解。此外最近有26例患者接受了utomilumab联合pembrolizumab（NCT02179918）治疗，26％的患者已确认有完全或部分缓解¹²。该研究中观察到的抗肿瘤活性将进一步支持4-1BB激动剂与PD1和PDL1阻断抗体组合的研究。

7抗CD28激动剂抗体

在临床开发中仅有一种CD28激动剂抗体TAB-08（theralizumab，正式名为TGN1412），从该药物可以了解到免疫共刺激激动剂抗体发展中的风险。2006年，6名接受单一剂量TAB-08的健康志愿者经历了细胞因子释放综合征（CRS），所有患者都患有免疫相关的多器官衰竭，随后证实患者组织中的效应记忆T细胞是TGN1412处理后负责CRS细胞因子的来源，进一步的机理研究确定在该研究中观察到的严重CRS是测试中高剂量TAB-08导致的。经过慎重考虑，TAB-08的人体测试于2011年开始，剂量比2006年测试的低1000倍。降低剂量水平的TAB-08在所有30名健康志愿者中耐受良好。当然必须确定在癌症患者中是否可以建立治疗窗口，以期在没有严重全身性CRS的情况下诱导抗肿瘤免疫激活。

8抗ICOS激动剂抗体

针对ICOS的激动剂抗体是临床开发的新成员，因而具有最少的临床数据。靶向ICOS的基本原理源于作为ipilimumab（抗-CTLA4）临床开发计划获得的生物标志物数据，其中T细胞中ICOS的上调与增加的反应概率或延长的存活相关。机制的联系使得抗CTLA4抗体成为与ICOS激动剂组合的理想候选者，并且临床前证据也支持这种组合。另外ICOS、CD28和CTLA4之间也存在信号传导相似性并与PD1存在较小程度相似性。重组鼠ICOS配体在小鼠模型中显示出抗肿瘤活性，而临床开发中的两种ICOS激动剂抗体GSK-3359609和JTX-2011均于2016年开始临床试验，目前正在测试ICOS激动剂抗体单独使用以及与PD1阻断抗体联合使用的治疗效果。GSK-3359609是人源化IgG4抗体，而JTX-2011是人源化IgG1抗体。两种抗体之间的同种型差异可能导致它们的独特机制特征。GSK-3359609的工程化IgG4形式被设计成在没有细胞耗竭功能情况下刺激T细胞激活的激动剂，而ADCC效应能够使JTX-2011的IgG1同种型诱导FcγR介导的ICOS⁺ T细胞消耗。许多肿瘤浸润性T_reg细胞是ICOS⁺，表明这些细胞的消耗将在一些临床环境中有助于治疗效果。然而，一些肿瘤中CD4⁺辅助细胞和细胞毒性CD8⁺ T细胞的ICOS表达也很高，因此必须考虑ICOS激动剂是否也可导致FcγR介导的ICOS⁺效应T细胞群的ADCC消耗。来自肿瘤治疗的临床生物标志物数据证明了这些机制的免疫调节影响，这有助于了解ICOS激动剂抗体的全部治疗潜力，也有助于更好地选择患者群体以及药物组合。

9激动剂抗体的新靶点和替代形式

在针对几种共刺激受体靶点的临床前开发中存在许多额外的激动剂抗体和蛋白质，包括DR3、HVEM、TMIGD2（跨膜和免疫球蛋白结构域包含蛋白2）和NKG2D。已经有研究报道了这些药物的有限表征，但仍需要额外的研究来支持这些受体的共刺激功能。另外已经开发出具有替代形式的治疗药物以对抗共刺激受体，包括双特异性抗体和重组配体。

10双特异性抗体和TNFR激动剂

在血液恶性肿瘤和实体肿瘤的早期临床中广泛评估了共刺激激动剂抗体与检查点阻断和标准护理治疗的联合。TNFR共刺激在临床应用中的潜在限制是诱导与自身免疫相关的全身性副作用。为了解决这些问题，早期研究是使用抗肿瘤相关抗原（TAA）抗体以将TNFR激动剂引导至肿瘤微环境。AbbVie已开始进行肿瘤定向抗CD40双特异性抗体（ABBV-428）的I期临床试验。CD40受体的激动剂激活可以激活和成熟APC，导致抗原特异性CD8⁺ T淋巴细胞的高效引发、激活和增殖。此外，使用稳定的CD40L三聚体激活CD40受体已成为疫苗佐剂策略，然而免疫系统的激活表现出剂量限制副作用，这些副作用正通过靶向给药策略得到解决。将ABBV-428双特异性抗体靶向递送至肿瘤旨在提高治疗功效，同时通过肿瘤局部的APC活化和T细胞引发最小化与CD40受体系统激活相关的毒性作用。Pieris Pharmaceuticals正在开发一系列双特异性抗体，通过使用TAA特异性抗体诱导4-1BB的聚集和激活。例如靶向GPC3和4-1BB的双特异性抗体（PRS-342）正处于临床前开发阶段，有望应用于肝细胞癌、Merkel细胞癌和黑色素瘤等4-1BB⁺肿瘤浸润淋巴细胞的癌症适应症。在相关策略中，Pieris生产的HER2定向的双特异性抗体，其靶向4-1BB，正处于I期临床试验中。抗体介导的稳定TNFR配体三聚体（CD27L、CD40L、4-1BBL和GITRL）的细胞表面固定或寡聚化可以高效激活局部同源受体的信号传导。在4-1BBL的情况下，使用含有单链可变区片段（scFv）和4-1BBL的融合蛋白（scFv-4-1BBL）能显著增加受体的激活。与这些观察结果一致的是Pieris双特异性抗体与TAA、GPC3或HER2的优先结合促进了4-1BB的聚集（交联）及随后肿瘤微环境中肿瘤特异性4-1BB⁺ T细胞的激活。

临床前的研究正聚焦使用抗TAA抗体将稳定的TNF配体三聚体递送至肿瘤。LIGHT（TNFSF14）可以结合两种细胞受体LTβR和HVEM，是一种抗肿瘤免疫的有效调节剂。肿瘤内的LIGHT可以促进趋化因子的产生、粘附分子的表达和三级淋巴结构的发展从而促进幼稚淋巴细胞浸润和活化，然而LIGHT的全身给药治疗效果有限。Tang及其同事通过构建抗EGFR和人类突变形式的LIGHT（可以与小鼠hmLIGHT结合）的融合蛋白，成功地为EGFR表达肿瘤输送了LIGHT三聚体，从而导致极大的抗肿瘤效果和逆转的PDL1耐受（图7）¹³。用抗EGFR-hmLIGHT双特异性构建体处理也可以以LTβR依赖性方式显著提高效应T辅助1细胞（T_H1）产生的趋化因子和细胞因子，例如干扰素γ（IFN-γ）、TNF和白介素12（IL12）。这些临床前研究表明肿瘤靶向TNFR激动剂具有产生强大的抗肿瘤免疫潜力。

图7：LIGHT三聚体抗肿瘤模式图

11六价TNFR激动剂

为了改进目前使用激动剂激活TNFR的策略，许多研究小组正在以六价构型构建稳定的TNFR配体三聚体，以最大化受体参与、聚集和靶细胞激活的效率。在同系小鼠模型中鼠GITRL融合蛋白（mGITRL-FP）激动剂可以诱导抗原特异性CD8⁺ T细胞的扩增和持久的CD8⁺ T细胞记忆发育并伴随肿瘤内T_reg细胞含量的减少，从而促进抗肿瘤免疫和肿瘤生长抑制。在CT26结肠癌模型中，mGITRL-FP与鼠OX40L融合蛋白（mOX40L-FP）或检查点阻断剂（PD1、PDL1或CTLA4）的组合比单药治疗具有更强的抗肿瘤活性。这些发现为进一步探索GITRL与OX40激动剂和PD1/PDL1拮抗剂的组合策略提供了临床前的支持。为了将该策略扩展到临床，MedImmune开发了一种六聚体人GITR激动剂MEDI1873，其包含一个IgG1 Fc结构域和人GITRL胞外结构域的稳定三聚体。在非人灵长类动物中，MEDI1873可以剂量依赖性地改善抗原特异性体液和T细胞增殖反应。这些研究使得在早期临床开发中可以考虑使用六聚体GITRL激动剂促进抗肿瘤免疫。因此MedImmune启动了I期临床试验以评估MEDI1873在晚期实体瘤患者中的安全性和有效性。OncoMed也于2017年9月宣布启动其三聚体GITRL-Fc融合蛋白（OMP-336B11）的I期临床试验。

图8： 六价TNFR激动剂

抗体介导的受体活化的新兴替代方案是开发包含稳定TNFRL三聚体的Fc融合构建体。人Fc结构域与每个单链TNFR结合结构域的羧基末端融合产生具有六价受体结合的同型二聚体分子。设计六价结构以促进靶细胞上有效的TNFR聚集和活化，而与Fc介导的交联无关。六价TNFR激动剂正处于临床前发现和I期临床试验中。

致力于更广泛地使用TNFR配体作为受体激动剂，Apogenix开发了一种六价TNF超家族受体激动剂（HERA）平台，靶向CD40、CD27、HVEM、OX40、GITR、4-1BB和TNF相关凋亡诱导配体（TRAIL）。HERA激动剂由一条多肽链构成，该多肽链由三个重复的TNFR结合区域（scTNF-RBD）组成，这些区域通过肽链连接，当折叠成蛋白质时，这些肽链会三聚化。将人IgG1的Fc结构域融合至每个scTNF-RBD的羧基末端产生具有六价受体结合的同型二聚体分子。设计HERA平台的六价结构以促进TNFR的聚集和下游信号的传导，而不依赖于Fc介导的交联。Apogenix正在与AbbVie合作，在HERA平台上开发TRAIL受体1（TRAILR1）和TRAILR2激动剂，例如被设计用于诱导免疫原性肿瘤细胞死亡的APG880（ABBV-621）。另外，Apogenix报道其HERA-GITRL在CD-1小鼠体内是稳定的，并且在使用来自健康供体的人CD4⁺淋巴细胞的功能测定中可以促进淋巴细胞激活、增殖和效应细胞因子（TNF和IFNγ）的产生。这种临床前分子管道代表了一种新型且仍在发展中的高效TNFR激动剂技术。

12总结

靶向免疫共刺激受体的激动剂抗体已经在临床上进行了超过10年的测试，然而迄今为止尚未有药物得到批准上市，也没有任何开始的III期随机试验，说明了激动剂抗体设计和开发的复杂性。在开发这些药物所需的临床试验设计中，发现和表征激动剂抗体所固有的挑战使得激动剂抗体与用于开发其他癌症抗体疗法的方法相比具有独特性。没有一组生物物理特性或概况可以重复预测抗体将作为激动剂，只有通过全功能表征才能确信抗体具有激动剂特性，但即便如此二级机制（如ADCC）也会使其效应的解释复杂化。

在过去的几年中，关于什么样的抗体特性使其成为有效激动剂的知识已经得到极大地扩展，特别是认识到IgG同种型和Fc结构域特性与用于制备有效免疫激动剂抗体的Fab结构域同样重要，这有助于设计更好的激动剂。另外临床前实验证明了免疫激动剂抗体在癌症治疗中的前景，特别是当与其他免疫激活方法联合使用时。因此最近该领域呈现爆发趋势，目前正在开发的25种不同抗体中的大多数已在过去3年内进入临床试验阶段。许多最有希望的共刺激受体靶点现在具有六、七个正在进行临床评估的竞争性抗体项目，以确定每种药物的最有效剂量、方案和组合方法。通过抗体拮抗剂开发获得的最大治疗效果相关的最佳靶点饱和度、剂量频率和持续时间可能不适用于免疫激动剂类中的大多数抗体。因此必须制定新的临床设计、建立新的规则和评估替代方法以确定如何最好地使用这些疗法。此外，在接受激动剂治疗时，患者的免疫谱、T细胞亚群和受体表达也是极其重要的考虑因素。我们要理解这些激动剂抗体在不同亚群中的作用并相应地给与指导治疗，因为即使两个患者具有相同的癌症诊断，一些激动剂疗法仍然可能在具有一种免疫谱的患者中具有高活性，但在具有另一种免疫谱的患者中没有活性。

免疫共刺激受体是抗肿瘤免疫细胞功能的重要组成部分，有效激活这些受体可能具有重要的治疗益处，并有助于丰富免疫肿瘤学中的治疗方案。激动剂抗体成功的关键可能在于确定在什么样的治疗环境和患者群体中以及与哪些药物组合可以为其提供最大的治疗益处。在这方面，综述所述的一些旨在通过精心设计的单克隆抗体、重组配体和双特异性抗体激活免疫共刺激受体的下一代方法可能有助于释放这类靶点的全部治疗潜力。总之激动剂抗体激活机制的深入研究和激动剂抗体的临床开发必将和PD1抑制剂一样给无数癌症患者带来新希望。

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拓展阅读